Костный мозг Подготовка Пересадка

Исторические аспекты аллогенной трансплантации Костного Мозга (КМ).

Начало

Первые попытки по использованию костного мозга для клинических целей были описаны в 1939 (Osgood E.E.) и 1940 годах (Morrison M.). В этих исследованиях, основываясь на интуитивных идеях о стимуляции эритропоэза, проводилась попытка лечения пациентов с апластической анемией с помощью ежедневных внутривенных или внутрикостных инъекций небольших объемов свежеизолированного костного мозга (несколько миллилитров). Тем не менее, авторы не смогли обнаружить сколько-нибудь значимого клинического эффекта.

Первые конструктивные исследования, ставшие предпосылкой для разработки методов клинической трансплантации костного мозга, были проведены группой L. Jacobson в 1949. Они проводили резекцию  селезенки  мышей, затем подвергали этих животных облучению в летальных дозах, после чего селезенку (необлученную) трансплантировали обратно. Было показано, что, несмотря на смертельные дозы облучения, животные экспериментальной группы выживают. Позднее L. Jacobson описал аналогичный эффект при интраперитонеальной инъекции аутогенных клеток селезенки, а группа Е. Lorenz (1951) при внутривенном введении аутогенных клеток костного мозга. Тем не менее, на этом этапе ученые полагали, что описанный феномен обусловлен «субстанцией неклеточной природы» (гормонами или какими-либо другими факторами) или, что радиация приводит к выработке «токсинов», которые «детоксицируются» селезенкой и/или трансплантируемыми клетками и тканями. При этом выживаемость мышей в этих исследованиях оценивалась в течение 30 суток, вследствие чего ученые не видели существенной разницы между аутологичными и аллогенными трансплантациями. Однако, уже в 1954 году Barnes и Loutit сообщили, что мыши, которым проводилась сингенная трансплантация костного мозга, выживали более 100 дней, тогда как мыши с аллогенной трансплантацией около 30, при этом они погибали от «вторичной болезни». Эти наблюдения не могли быть объяснены с позиции «гуморальной» теории, вследствие чего Barnes и Loutit сформулировали «клеточную теорию». Клеточная теория была подтверждена в последующих исследованиях, в экспериментальных условиях которых ученые могли определять происхождение гемопоэтических клеток (трансплантация клеток костного мозга крысы облучённым мышам — Nowell et al – 1956, или трансплантация сингенных клеток костного мозга мышей, несущих маркер – хромосому с транслокацией Т6 — Ford et al, 1956).   

Ранние клинические исследования.

Основываясь на ранее полученных экспериментальных данных на мышах, некоторые группы ученых и клиницистов приступили к первым клиническим исследованиям, которые условно можно было разделить на два направления – лечение онкогематологических заболеваний и восстановление гемопоэза после облучения. Особенностью этих исследований стало то, что при выборе донора костного мозга никак не учитывалась гистосовместимость.  

  Доннелл Томас, лареат Нобелевской премии 1990 г.

— 1956 г. – группа Е.D. Thomas (Доналл Томас впоследствии стал лауреатом нобелевской премии 1990 года) и J.W. Ferrebee опубликовала данные по лечению 6 пациентов с онкогематологическими заболеваниями в терминальной стадии. Лечение заключалась в облучении с последующей трансплантацией костного мозга от здоровых добровольцев. Только  у одного пациента было выявлено транзиторное приживление трансплантата. Все больные вскоре погибли. Впоследствии многие клиницисты также неудачно пытались использовать аналогичный подход – в 1970 году М. Bortin суммировал эти данные в обзоре, в котором сообщалось о 200 неудачных трансплантаций костного мозга, проведенных по этой методике.

 — 1959 г. – французская группа G. Mathé сообщила о лечении 5 физиков, которые получили высокие дозы облучения в атомном реакторе в Югославии. Пациентам проводились инфузии костного мозга от разных доноров. Из 5 человек выжило 4. Тем не менее, было признано, что у всех выживших пациентов произошло восстановление кроветворения за счет собственных гемопоэтических клеток. Впоследствии G. Mathé пытался проводить адаптивную иммунотерапию гемобластозов с помощью трансфузий аллогенного костного мозга. Несмотря на то, что в итоге все погибали, у некоторых пациентов удавалось достигнуть полной ремиссии в течение 5-9 месяцев, что можно было считать первым доказательством эффективности адаптивной иммунотерапии. Впоследствии они погибали либо от инфекций, либо от «вторичного заболевания» (РТПХ).                                                

                                                                                                                                                                                                            Джордж Матэ

— 1959 г. — Е.D. Thomas и J.W. Ferrebee сообщили о трансплантации костного мозга между однояйцевыми близнецами. Пациента с лейкозом в терминальной стадии облучили в дозе 748 рад (ранее было показано, что подобная доза приводит к панцитопении и гибели) и затем провели внутривенно трансплантацию костного мозга от здорового близнеца. Кроветворение пациента было восстановлено, а ремиссия продлилась 4 месяца. Из этого клинического случая было сделано два важных вывода. Во-первых, облучение в сочетании с трансплантацией костного мозга обладает выраженным противоопухолевым эффектом. Во-вторых, внутривенная инфузия совместимого костного мозга может привести к восстановлению кроветворения и предотвращению смерти после облучения в летальных дозах.

Прогресс в экспериментальных исследованиях.

Первые эксперименты и клинические исследования показали, что приживление аллогенного костного мозга связано с большими трудностями. В связи с этим многие исследовательские группы сосредоточились на экспериментальных исследованиях, направленных на изучение и разрешение возникших проблем.

РТПХ.

В 1959 году группа Billingham и Brent опубликовала ключевые исследования, посвященные РТПХ (тогда называемую «вторичная болезнь» или «карликовая болезнь»). А в 1966 Billingham и Brent детально описали биологию РТПХ в своем обзоре, многие постулаты из которого актуальны и по сей день:

— сингенные клетки не приводит к возникновению «карликовой болезни» (РТПХ).

— персистенция аллогенных клеток в организме реципиента необходима для возникновения «карликовой болезни».

— возникновение и тяжесть «карликовой болезни» обусловлены антигенными различиями между донором и реципиентом.

Кроме того, Uphoff (1958) и Lochte (1962) показали, что лечение РТПХ можно проводить путём введения Метотрексата.     

Криоконсервация.

В 1955 году была продемонстрирована успешная криоконсервация клеток костного мозга с помощью глицерина. Однако  у этой методики был существенный недостаток – перед введением реципиенту глицерин надо было отмывать с помощью весьма сложной процедуры. В 1962 году Cavins et al. продемонстрировали, что клетки костного мозга собак можно криконсервировать с помощью диметилсульфоксида (ДМСО), при этом также было продемонстрировано, что размороженные клетки можно вводить реципиенту без отмывки от ДМСО. Эта техника стала стандартом в области трансплантации костного мозга.

Гемопоэтические клетки периферической крови.

В 1962 год Goodmanи Hodgson показали, что облучённые мыши могут быть защищены от гибели путём инфузии клеток крови. В 1964 Cavins показал, что лейкоцитарную взвесь, полученную из периферической крови, может заморозить с ДМСО и в дальнейшем использовать для инфузии облучённым реципиентам с успешным восстановлением гемопоэза. Эти исследования заложили основу для разработки методов автоматической сепарации мононуклеарных клеток периферической крови, а также мобилизации гемопоэтических клеток в периферическое кровообращение.

Ключевые исследования на собаках.

Доклинические исследования с использованием аутбредных (беспородных) собак были наиболее информативны, так как проблемы, возникающие у них при аллогенных трансплантациях костного мозга (неприживление трансплантата, отторжение трансплантата, РТПХ, оппортунистические инфекции и др.), во многом были схожи с таковыми, наблюдаемыми у людей. Начиная с 1958 года Е.D. Thomas и J.W. Ferrebee и другие группы выполнили большое количество экспериментов с аллогенными трансплантациями у собак. Лишь у небольшого количества животных не возникало каких-либо из перечисленных выше проблем, и они выживали. В этих случаях, вероятно, существовала достаточная гистосовместимость между донором и реципиентом, однако в 1960 году методов оценки тканевой совместимости пока еще не существовало.

Прогресс в области изучения гистосовместимости.

Разработка техники определения гистосовместимости являлось ключевой предпосылкой для разработки методов аллогенной трансплантации костного мозга. В 1954 году впервые описали антитела, которые распознавали антигены на поверхности лейкоцитов и возникали после трансфузий клеток крови или беременности. Через 4 года независимо друг от друга французская и голландская группы Daussetи van Rood описали собственно HLA-антигены, а также установили принципы их наследования. В дальнейших многочисленных исследованиях была установлена роль этих антигенов в трансплантации.

 Жан Доссе, лауреат Нобелевской премии 1980г.

В 1968 году Epstein и Storb получили типирующие сыворотки для определения лейкоцитарных антигенов собак (СЛА). В последующих исследованиях этой группы было показано, что трансплантация костного мозга между несовместимыми животными из одного помета всегда неудачна. В тоже время при трансплантации между совместимыми особями одного помета наблюдалась значительно более длительная выживаемость реципиентов. Добавление непродолжительного курса Метотрексата для иммуносупресии после трансплантации увеличивало выживаемость реципиентов до 90% или даже более (Storb  R.,  Epstein  R.B.,  Graham  T.C.,  Thomas  E.D. – 1970 г.). Таким образом, описанные исследования на собаках показали ключевое значение совместимости по лейкоцитарным антигенам при аллогенных трансплантациях костного мозга. 

В 1964 году Terasaki и McClelland получили сыворотки для типирования лейкоцитарных антигенов человека. А в 1969 Terasaki показал ключевое значение HLA-совместимости в исходе трансплантаций почки между сиблингами.

 В 1965 году французский ученый G. Mathé опубликовал статью в Cancer Reserch «Adoptive Immunotherapy of Acute Leukemia: Experimental and Clinical Results», в которой, по сути, впервые в мире сообщалось об успешном долговременном приживлении аллогенного родственного костного мозга (сиблинг) у одного из больных с острым лейкозом. В течение 11 месяцев после трансплантации у пациента наблюдались полная ремиссия и 100% химеризм эритроцитов (определялось по антигенам групп крови). Иммуноглобулины сыворотки крови также имели антигенные характеристики донора. При этом трансплантация кожного лоскута от того же донора не вызывала реакцию иммунного отторжения, т.е. имела место донор-специфическая иммунологическая толерантность. К сожалению, через 11 месяцев пациент умер от вирусной инфекции и тяжелых проявлений «вторичной болезни» (хронической РТПХ). Важным выводом в этой статье также стало констатация факта, что для успешного приживления аллогенного костного мозга у человека необходимо предварительное подавление иммунной системы реципиента.      

Клинические исследования «второй волны»…

После неудачных попыток в конце 1950-ых и начале 1960-ых годов в научных и медицинских кругах сформировалось скептическое мнение о возможности проведения успешных аллогенных трансплантаций костного мозга у человека. Многие исследовательские группы переключились на другие области исследований. Тем не менее, прогресс в трансфузионной медицине, в лечении инфекционных осложнений, и, самое главное, в разработке методов определения тканевой совместимости, позволил сразу нескольким исследовательским группам приступить к новым клиническим испытаниям.

Важным отличием испытаний «второй волны» от первоначальных стал подбор родственного донора среди сиблингов по принципу гистосовместимости.  

Одной из ключевых дат в области аллогенных трансплантаций костного мозга стал 1968 год – сразу три исследовательских группы провели успешные трансплантации аллогенного родственного костного мозга (доноры — сиблинги) пациентам с наследственными иммунодефицитными заболеваниями.

 Роберт Гуд

Первой пришла позитивная новость от группы блестящего ученого доктора Роберта Гуда (Robert Good, «Боб») из университета Миннеаполиса. Трансплантация проводилась 5-месячному мальчику, которому ранее в Бостоне был поставлен диагноз «тимусная алимфоплазия и агаммаглобулинемия» (Х-связанный тяжелый комбинированный синдром иммунодефицита, SCID). В  семье этого пациента в течение трех поколений было выявлено 11 случаев этого заболевания с летальным исходом. Причиной смерти в раннем детстве во всех случаях являлись тяжелые инфекции.

У мальчика было 4 родных сестры, в связи с чем вероятность наличия совместимого сиблинга была очень высока. На основании серологического типирования по антигенам HLA 1 класса (выполнено в лаборатории Terasaki в университете Калифорнии) и клеточного типирования в реакции смешанной культуры лимфоцитов (выполнено Meuwissen в Миннеаполисе) одна из сестер восьми лет была выбрана в качестве оптимально совместимого донора. Клетки периферической крови и костного мозга донора были введены интраперитонеально. Через неделю после трансплантации у пациента появились признаки острой РТПХ с поражением кожи, печени и тонкой кишки, а также гемолитической анемии вследствие ABO-несовместимости. Иммуносупрессивная терапия не проводилась, так как симптомы РТПХ были умеренно выражены и, кроме того, считалось, что соответствующие препараты подавляют приживление гемопоэтических стволовых клеток. Спустя еще одну неделю основные симптомы РТПХ самопроизвольно разрешились, и были выявлены признаки восстановления гемопоэза. При этом 25% клеток из образцов костного мозга имели женский кариотип.

Тем не менее, через 45 суток после трансплантации у пациента развилась тяжелая апластическая анемия, что было расценено как РТПХ с вовлечением костного мозга. Была выполнена вторая инфузия костного мозга от того же донора. В течение двух недель уровень лейкоцитов в периферической крови восстановился до нормальных значений, проявления РТПХ самостоятельно разрешились, а эритроциты несли антигены группы O – группы крови донора. Обследования, проведенные в течение двух лет, подтвердили наличие у пациента полноценного иммунитета.

                                                                                                                                                                                                                                       Фриц Бах

Вторая позитивная новость пришла от группы Фрица Баха (Fritz Bach) (считается разработчиком метода определения гистосовместимости в реакции смешанной культуры лимфоцитов) и Мортимера Бортина (Mortimer Bortin) из университета Висконсин. Трансплантация проводилась 22 месячному мальчику с синдромом Вискотта-Олдрича, также являющимся наследственным Х-сцепленным заболеванием. В отличие от пациентов с SCID, у больных с синдромом Вискотта-Олдрича по крайней мере часть иммунологических функций сохранена. Поэтому для предотвращения возможного отторжения проводилась кондиционирование с помощью Азатиоприна и Преднизолона в течение двух дней. Клетки костного мозга от совместимой сестры (серологическое типирование по HLA 1 класса и реакция смешанной культуры лимфоцитов) вводились внутривенно. Тем не менее, полноценного восстановления гемопоэза не произошло – пациент нуждался в периодических трансфузиях концентрата тромбоцитов, химеризм клеток периферической крови и восстановление лимфоцитов отсутствовали. Спустя месяц была выполнена повторная трансплантация  периферической крови и еще через 5 суток  ядросодержащих клеток костного мозга от того же донора. В течение последующих несколько недель произошло восстановление уровней лейкоцитов и эритроцитов. 15 лет спустя у пациента наблюдался полный Т-клеточный и частичный B-клеточный химеризм в периферической крови, однако в костном мозге присутствовали только клетки с XY-кариотипом, а уровень тромбоцитов оставался низким. Тем не менее, у пациента не наблюдались серьезные инфекционные осложнения, характерные для синдрома Вискотта-Олдрича, а также возможные кровотечения.

Статьи об этих двух клинических случаях были опубликованы в декабре 1968 года в одном из декабрьских номеров Lancet.

Джон Ван Руд

Наконец, третья трансплантация 5-месячному пациенту с синдромом SCID была выполнена в 1968 году в Нидерландах группой Джона ван Руда(Jon van Rood) в университетском госпитале Лейдена. В этом случае проводилась совместная трансплантация клеток костного мозга от совместимой сестры (серологическое HLA-типирование и реакция смешанной культуры лимфоцитов) и неродственного фетального тимуса.  3 месяца спустя у пациента наблюдалась нормальная прибавка в весе и восстановление всех ростков кроветворения, клеточного и гуморального иммунитета. Кариотипирование лимфоцитов периферической крови на 80 сутки после трансплантации показало 97% химеризм. Интересно, что для предотвращения инфекционных осложнений за неделю до трансплантации и до восстановления гемопоэза пациент был помещен в камеру со стерильным ламинарным потоком воздуха. Клинический случай был опубликован в июне 1969 года в Lancet.

 В 1967 году сильная группа из Сиэтла, в которую входил и Донелл Томас, получила значительный грант на поддержку своих исследований. Весь 1968 год у них ушел на подготовку соответствующей инфраструктуры, и первую трансплантацию эта команда выполнила в марте 1969 года. Пациентом являлся 46-летний мужчина с хроническим миелоидным лейкозом в фазе бластного криза. Выполненное типирование показало, что у больного был совместимый сиблинг (сестра). После тотального облучения в дозе 954 рад была проведена внутривенная трансплантация клеток костного мозга. Признаки приживления трансплантата